Tezuka là con cả trong một gia đình có ba đứa con ở thành phố Toyonaka, tỉnh Ōsaka.[2][3] Biệt danh của ông là gashagasha-atama (gashagasha là từ tiếng lóng chỉ sự lộn xộn, atama nghĩa là cái đầu). Mẹ của ông thường an ủi anh bằng cách bảo ông nhìn lên bầu trời xanh, mang tới cho ông sự tự tin. Những câu chuyện của người mẹ cũng là nguồn khơi gợi cảm hứng cho sự sáng tạo của ông. Tezuka lớn lên ở thành phố Takarazuka, tỉnh Hyōgo, và mẹ ông thường đưa ông tới rạp hát Takarazuka. Các vở kịch của đoàn kịch Takarazuka được biểu diễn bởi phụ nữ, bao gồm các nhân vật nam. Đoàn kịch Takarazuka được biết đến với những vở nhạc kịch lãng mạn, thường nhằm vào khán giả nữ, do đó có ảnh hưởng lớn đến những tác phẩm sau này của Tezuka, bao gồm cả các thiết kế trang phục của ông. Ông đã từng nói rằng, ông có một "tinh thần hoài cổ" sâu sắc đối với Takarazuka.[4]

Tezuka bắt đầu vẽ truyện tranh vào khoảng năm thứ hai của mình ở trường tiểu học. Vào khoảng năm thứ năm, ông tìm thấy một con bọ có tên là "Osamushi". Nó giống tên của ông đến mức ông nhận Osamushi là bút danh của mình. Ông đã nhận ra một điều, rằng ông có thể sử dụng manga như một phương tiện giúp thuyết phục mọi người chăm sóc thế giới. Sau Thế chiến II, ông đã tạo ra tác phẩm đầu tiên của mình (ở tuổi 17), Nhật ký Ma-chan và sau đó là Shin Takarajima (Tân đảo giấu vàng), bắt đầu thời đại hoàng kim của manga, một cơn sốt sánh ngang với truyện tranh của Mỹ ở cùng thời điểm.[5]